用高速冷凍離心機(jī)分離血清脂蛋白
2014-09-05(1961)次瀏覽
用高速冷凍離心機(jī)用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL,VHDL)比較成功,而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。
血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同,其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即:乳密顆粒,極低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。
一.梯度材料:血清脂蛋白密度較低,常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等,常用的緩沖劑為ED。
二.預(yù)分離:
1.血細(xì)胞與血清分離:離心參數(shù):全血,角轉(zhuǎn)頭,3000rpm×20min。結(jié)果:沉淀為血細(xì)胞,上部為血清。
2.乳糜粒分離:禁食12小時(shí)以上人血漿中乳糜粒含量極少,已進(jìn)食者因其血漿含乳糜粒高,應(yīng)先離心去除乳糜粒。
離心參數(shù):4×10(g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。梯度液配置:離心管下部3/4容積加血漿,上部1/4容積加0。5MnaCl 0.3MEDTA,ph7.4結(jié)果:乳糜粒上浮,吸出。
3.血清蛋白分離:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
離心參數(shù):(2。5-3)×10(g×hr),各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70,000rpm×6hrs,10°C
配置:管容量1/3為血清,2/3為1。31g/ml,NaCl NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
結(jié)果:管上部1/6容積為血清脂蛋白,下部5/6為其它蛋白。
三.離心方法:
1.順序浮選法:
a)超速法:最早使用的方法,4000rpm×24hrs×3次,10°CNaCl NaBr梯度按1。006,1。063,1。21順序浮選,每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作簡(jiǎn)單,分辨率高,得率高,費(fèi)時(shí),成本高。
b)超高速法:100,000rpm×2.5hrs×2次,10°C,100,000rpm×4hrs×1次,NaCl KBr EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL,LDL,HDL
2.單次離心法:
a)單次水平分離
用最高轉(zhuǎn)速為25,000~28,000rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/mlNaCl液及1。35g/ml(NaCl KBr EDTA)液配置成從1。006至1。21的8層不連續(xù)階梯度,最下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液,25,000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL,LDL,HDL不同層區(qū)帶。用最高轉(zhuǎn)速為40,000rpm,6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭,40,000rpm×24hrs,20°C,不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細(xì)長(zhǎng)管,分層清晰,回收率高,離心時(shí)間長(zhǎng)
b)單次垂直管分離:
NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml,轉(zhuǎn)速?gòu)?0,000rpm~80,000rpm,離心(0。5-3)hrs,下層用KBr或(NaBr)將血清調(diào)至1。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液,10°C-20°C,增加,減速一次分出。NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/WSucrose,中層血清在4MnaCl中,上層為0。67MNaCl 0.05%EDTA,離心參數(shù)同上,時(shí)間較長(zhǎng)。
c)區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離:
離心參數(shù):區(qū)帶轉(zhuǎn)頭,最高轉(zhuǎn)速30,000~48,000rpm,容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載,分離轉(zhuǎn)速:大轉(zhuǎn)頭(25,000-28,000rpm)×24hrs,小轉(zhuǎn)頭(30,000-38,000rpm)×1hrs,10°C-20°C梯度液:NaCl NaBr或KBr EDTA不連續(xù)或線性梯度,樣品在最大密度層,近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層,分離室最外部用高密度NaCl/KBr或NaCl/NaBr作緩沖層。
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