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近期，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部接連發(fā)布了多個關(guān)于做好非洲豬瘟疫情防控、非洲豬瘟實驗室檢測工作的相關(guān)通知，全國各地動物疾病預防控制中心、畜牧獸醫(yī)局、農(nóng)業(yè)局等相關(guān)單位紛紛進行非洲豬瘟相關(guān)檢測儀器設備的采購

非洲豬瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家豬和各種野豬（不傳染人）引起一種急性、出血性、烈性傳染病。其特征是發(fā)病過程短，最急性和急性感染死亡率高達100%，且只能依靠實驗室監(jiān)測確診。   

2018年8月3日我國確診首例非洲豬瘟疫情。

非洲豬瘟樣品處理

1. 目的

規(guī)范ASFV樣品和實驗材料的處理程序，保證ASFV相關(guān)實驗的順序開展和實驗室的生物安全。

2. 適用范圍

適用于疑似ASFV臨床樣品的實驗前的處理

3. 程序

3.1實驗材料

ASF的易感動物，主要為家豬、野豬和蜱，通常采集的樣品為家豬、野豬的血液樣品、組織樣品以及蜱三類。田間采集的樣品通常需要經(jīng)過簡單的預處理，才能進行后續(xù)的檢測、診斷工作。

血清：用于病毒核酸檢測、病毒抗原和抗體檢測。將采好的豬血的注射器或采血管在室溫下傾斜靜止2~4h（防止暴曬），或置于37℃溫箱內(nèi)1h，待大部分血清析出后，取出血清，必要時經(jīng)離心分離血清。（最低建議量5ml）。

抗凝全血：用于病毒核酸檢測和病毒抗原檢測。

采血前，在真空采血管或注射器內(nèi)按比例加入抗凝劑。采集血液，輕輕上下顛倒，使血液與抗凝劑充分混勻，防止血液凝固的同時避免溶血。也可以將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，震蕩脫落纖維蛋白。必要時，可加入雙抗以抑制血源性或采血過程中可能出現(xiàn)的細菌污染。

當血樣用于病毒核酸檢測時，一般不用肝素而選用EDTA作為抗凝劑。（最低建議量1mL）。

組織樣本：活體采集，采用扁桃體，用于臨床健康動物ASF監(jiān)測。

尸體剖檢ASF發(fā)病動物或死亡動物經(jīng)解剖取材，包括：ASFV靶器官的采集：脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、扁桃體。

其他病變組織臟器的采集：采集具有明顯病變的肝臟、肺臟、心臟等組織器官，選取部位在病變和健康組織交界處。

腐敗動物尸體的樣品采集：剖檢取股骨，將附著的肌肉和韌帶等全部剔除，采集骨髓。最低建議量5克。

蜱的采集：蜱可進行核酸檢測、抗原檢測和蜱的形態(tài)學鑒定，查找豬圈的墻邊、墻縫、木質(zhì)或瓦質(zhì)的屋頂，或挖掘豬圈地面均可能找到蜱，也可查看豬表皮，采集蜱。

1-1樣品保存條件

注：用于病毒分離和病理學檢測的樣品禁止-20℃保存。

3.2實驗器材和試劑

1）臺式高速冷凍離心機、組織研磨儀、水浴鍋、計時器、冰箱和移液器等。

2）無菌的剪子、鑷子、鋼珠、2mLEP管、移液器吸頭（10μL,200μL、1000μL）等。

3）其他試劑和耗材主要包括：0.01mol/L PBS（PH7.2）、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。

3.3樣品處理程序

3.3.1血清及全血樣品處理

取血清或全血樣品1mL于滅菌EP管里，保存?zhèn)溆?span>

3.3.2組織樣品處理

適用于脾臟等組織樣品和蜱的處理。盡可能減少污染，每取一個組織塊或蜱，用火焰消毒剪鑷等取樣器械，組織塊應分別放入滅菌容器內(nèi)并立即密封，做好標記，注意防止組織間相互污染。

3.3.2.1組織樣品的處理應在二級生物安全柜中進行，勿使液體濺到生物安全柜中。

3.3.2.2將0.1-0.2g組織塊放入2mLEP管中，用剪刀剪成碎塊，加1-2mL0.01mol/L PBS（PH7.2）,再加入1-2粒滅菌鋼珠，密封后，表面消毒備用。剩余樣品放回容器內(nèi)，重新密封，表面消毒后保存-70℃冰箱。

3.3.2.3組織樣品的破碎可以利用組織研磨儀在生物安全柜外操作，將樣品制成組織懸液。

3.4病毒滅活

病毒的滅活處理應在二級生物安全柜中進行，將處理好的血清、全血或者研磨破碎后的組織樣品連同EP管放入60℃水浴中，放置30min滅活。

3.5使用后儀器處理

剪刀、鑷子等均應放入消毒缸進行消毒，放入鐵飯盒內(nèi)，并裝入密封袋內(nèi)進行高壓滅菌處理。裝有組織樣品保存液的容器和盛有組織塊的離心管應密封管口，表面消毒后放入密封袋中高壓滅菌。鋼珠、吸頭等廢棄物應用0.8%NaOH浸泡30分鐘消毒后，置密封袋內(nèi)高壓滅菌。消毒殘液應裝入密封容器內(nèi)高壓滅菌處理。

3.6注意事項

操作之前要確認生物安全柜和實驗室已進行了徹底的衛(wèi)生消毒處理，防止樣品間交叉感染。

病毒殺滅和防控方式

非洲豬瘟病毒雖然在環(huán)境中比較穩(wěn)定，但在豬肉烹煮處理過程中較易失活，70℃-75℃加熱30分鐘以上，病毒就會被殺滅，也就是說我們?nèi)粘Ｅ腼冞^程中只要把豬肉熟透(包括最中間部位溫度至少達到70℃以上)，即使有病毒也會很快失去感染力并喪失活性。

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